Cepario de Bacteria Gram Negativas

Perfil De Proyecto

1.  Título del proyecto:

Elaboración de cepario de bacterias beneficiosas Gram negativas para el laboratorio de Microbiología de la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE.

2.  Definición y justificación del problema:

El desarrollo de materias de docencia e investigación en la Universidad de las Fuerzas Armadas ESPE en el área de Microbiología conlleva a la necesidad de disponer de una colección preservada de microorganismos Gram negativos para su estudio, examinación y análisis. Esta colección o cepario permite atender las necesidades del laboratorio en cuanto al abastecimiento de cepas para el desarrollo experimental de las asignaturas y proyectos de interés (UNAM, 2014). Por medio de este proyecto se desea aumentar la disponibilidad de bacterias Gram negativas manteniendo intactas sus características bioquímicas y reproductivas, considerando el método adecuado para cada uno de los géneros y especies que se conservarán en el cepario (UNC, 2016).

3.  Objeto de estudio.

El objeto de estudio es la creación del cepario, exclusivo para bacterias Gram negativas, tales como Azotobacter, Acetobacter, Pseudomona y Geobacter.

4.  Campo de investigación.

El proyecto pertenece a la línea de investigación de Microbiología y Ambiente.

5.  Sistema de objetivos

Objetivo principal:

Elaborar un cepario de bacterias Gram positivas para el laboratorio de Microbiología de la Universidad de las Fuerzas Armadas

Objetivos específicos

·  Identificar técnicas que nos permitan verificar la presencia del microorganismo deseado en el cultivo.

·  Establecer un sustrato específico para el crecimiento del microorganismo.

·  Mantener el cultivo en estado puro.

·  Determinar el tiempo adecuado de uso del cepario.

6.  Hipótesis

Hacer un cepario de bacterias Gram-negativas que permita la utilización de los microorganismos en estudios realizados en los laboratorios de Microbiología de la Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE.

7.  Marco teórico

Azotobacter

Las bacterias del género Azotobacter son fijadoras de nitrógeno de vida libre, solubilizadoras de fósforo y productoras de sustancias promotoras del crecimiento. Debido a que su principal característica consiste en la fijación del nitrógeno presente en la atmósfera, de manera que quede accesible para la planta,  significa un aporte natural de nitrógeno (Flores, 2014). Este género se encuentra en abundancia en la rizósfera, de suelos con alto contenido de materia orgánica, fosfatos, y valores de ph cercanos a la neutralidad. 

Acetobacter

Las acetobacterias son un grupo de microorganismos gramnegativos que se desarrollan en distintas plantas. La mayoría de los géneros de esta familia soportan altas concentraciones de sacarosa, así como de sus componentes, glucosa y fructosa. Además, muchas de ellas son capaces de crecer en presencia de ácido acético, produciendo acidificación cuando crecen en presencia de etanol. La relación fisiológica de las acetobacterias también está dada desde el punto de vista filogenético (Fuentes, 2009).

Pseudomona

Este género es un bacilo gramnegativo aerobio, es una rizobacteria promotora del crecimiento, está ampliamente distribuida en el medio ambiente ya que tiene bajos requerimientos nutricionales y utiliza una amplia gama de fuentes de carbono. Actualmente se estudia este grupo de bacterias por su capacidad para producir enzimas y metabolitos con efectos antagónicos sobre diversos fitopatógenos, mediante la inducción de resistencia sistemática, entre algunos componentes, podemos encontrar ácido salicílico. Este género también promueve el crecimiento vegetal gracias a la producción de sideróforos, fitohormonas y a producción de ácidos orgánicos y sustancias quelantes para la solubilización de fosfatos (Caviedes, 2010).

Estas bacterias se usan a nivel industrial por los metabolitos que produce. Un ejemplo es la cepa P. denitrificans, utilizada para la producción de vitamina B12, producción de exopolisacaridos por la cepa P. fluorescens, poliésteres bacterianos por la cepa P- oleovorans, entre otros (Alanis & Guerrero, 2004). P. aeruginosa, es también una bacteria electrogénica, permite la trasferencia indirecta de electrones (Lawlor, 2016).

Geobacter

Son bacterias gram-negativas clasificadas en el grupo Deltaproteobacterias, están caracterizadas por la presencia de apéndices celulares, flagelos y pili. Esta especie tiene la peculiaridad de poder oxidar totalmente los compuestos orgánicos empleando un electrodo como único aceptor de electrones, esta característica la vuelve idónea para la producción de energía renovable, la bioelectricidad, mediante la producción de celdas de combustible microbianas (Falcón, Lozano, & Juárez, 2009). Geobacter es una fiel representante de las bacterias electrogénicas, por su capacidad de transmitir directamente los electrones a un ánodo por medio de pilis (Lawlor, 2016). También es un género con capacidad destructiva de contaminantes, derivados el petróleo y reducción de metales pesados, por lo que se considera con alta capacidad de biorremediación (Bohrt, 2012).

8.  Metodología

Aislamiento

Se procederá a recolectar 200 g de tierra de un terreno ubicado en la localidad de Pasochoa. Esta tierra será el material del cual se aislarán las bacterias. Para el aislamiento primero se debe diluir la muestra.

Dilución de la muestra.

Se pesaran 10 g de la muestra natural y en condiciones asépticas se vaciará en un matraz Erlenmeyer con 90 mL de SSI estéril. Luego se procederá a homogeneizar y a partir de esta suspensión se prepararan 2 diluciones decimales más (10-2 y 10-3 ), para ello se emplearan dos tubos con 9 mL de SSI estéril c/u. (Guía Práctica 5.1.Aislamiento de Microorganismos. Mejía, Adriana;2015).

Preparación de la suspensión y liofilización.

Se depositarán 20 µL de la suspensión de microorganismo a liofilizar, en una placa de Agar TSA, se diseminará en forma de césped e incubará de 18 a 24 h a 35 °C, se colectará un cuarto del crecimiento del cultivo con un hisopo estéril, e inocularan Erlenmeyers que contengan 100 mL de medio CTS, se colocaran en zaranda a 37 °C y 170 r/min durante 2 h. Las células seran colectadas por centrifugación a 4 °C durante 30 min a 10 000 r/min. La biomasa se resuspendirá en 50 mL de las diferentes disoluciones lioprotectoras (leche descremada y glicerol 20 %), y se homogeneizará completamente. Se distribuirán 1 mL en bulbos estériles y se colocará el tapón sobre la boca del bulbo y este sobre la bandeja de la liofilizadora (Guía de Conservación de cepas microbianas por el método de liofilización para el control microbiológico en Laboratorios Liorad. Burguet, Nancy; 2012)    

Comprobación con características bioquímicas.

Para Acetobacter:

Las acetobacterias son un grupo de microorganismos gramnegativos que se desarrollan en distintas plantas. La mayoría de los géneros de esta familia soportan altas concentraciones de sacarosa, así como de sus componentes, glucosa y fructosa. Además, muchas de ellas son capaces de crecer en presencia de ácido acético, produciendo acidificación cuando crecen en presencia de etanol. La relación fisiológica de las acetobacterias también está dada desde el punto de vista filogenético (Fuentes, 2009). La identificación del microorganismo se llevará acabo acorde al Anexo 1.1.

Para Azotobacter

Las bacterias del género Azotobacter son fijadoras de nitrógeno de vida libre, solubilizadoras de fósforo y productoras de sustancias promotoras del crecimiento. Debido a que su principal característica consiste en la fijación del nitrógeno presente en la atmósfera, de manera que quede accesible para la planta,  significa un aporte natural de nitrógeno (Flores, 2014). Este género se encuentra en abundancia en la rizósfera, de suelos con alto contenido de materia orgánica, fosfatos, y valores de ph cercanos a la neutralidad. La identificación del microorganismo se llevará acabo acorde al Anexo 1.2.

Para Pseudomona

Pseudomona es un género de bacilos rectos gran negativos que poseen flagelos polares, se caracterizan por ser catalasa positivos y no formar esporas, además, son típicamente catalasa positiva. Se lo puede cultivar en medios simples, e identificarlos utilizando la clave dicotómica ubicada en la sección Anexos 1.3.

Para Geobacter:

Este género se caracteriza por ser anaeróbico, capacidad de acoplar la oxidación de diversos compuestos orgánicos a la reducción de iones metálicos; como el Fe(III), uno de los iones del hierro. Además, es capaz de transportar los electrones fuera de la célula a través de unos filamentos conductores, como los que se observan en la foto superior, llamados nanocables bacterianos. Para identificar este microorganismo se utilizara un agar selectivo para la bacteria, disponible en la sección Anexos 1.4.

9.  Resultados esperados

Se espera obtener una fuente de bacterias Gram-negativas a largo plazo que permita el desarrollo de investigaciones en los laboratorios de Microbiología de la Universidad de las Fuerzas Armadas- ESPE

10.  Viabilidad

Tabla 1.- Presupuesto estimado para la realización del proyecto

Presupuesto estimado para la realización del proyecto


11.  Cronograma

Tabla 2.- Cronograma estimado para la realización del proyecto

Cronograma de actividades




12.  Bibliografía

Alanis, E., & Guerrero, I. (2004). Pseudomonas en Biotecnología. Iztapalapa: BioTecnología. Obtenido de http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2004_1/Pseudomonas.pdf

Bohrt, M. (2012). INVESTIGACIÓN EN EL USO DE GEOBACTERIAS PARA LA PRECIPITACION DE URANIO EN AGUA SUBTERRANEA, PROCEDENTE DE LA MINA COTAJE. La Paz: Universidad católica boliviana "San Pablo".

Burguet, N. (2012). Conservación de cepas microbianas por el método de liofilización para el control microbiológico en Laboratorios Liorad. Obtenido de http://revista.cnic.edu.cu/revistaCB/articulos/conservaci%C3%B3n-de-cepas-microbianas-por-el-m%C3%A9todo-de-liofilizaci%C3%B3n-para-el-control

Caviedes, D. (2010). AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE Pseudomonas sp., y Bacillus sp., PROMOTORAS DEL CRECIMIENTO VEGETAL EN CULTIVO DE UCHUVA (Physalis peruviana L.) CON ACTIVIDAD ANTAGÓNICA FRENTE A Fusarium oxysporum. Bogotá: PUJ.

CONDA. (2005). GYC AGAR. Obtenido de https://www.condalab.com/pdf/2026.pdf

Falcón, A., Lozano, E., & Juárez, K. (2009). Bioelectricidad. México: BioTecnología. Obtenido de http://www.smbb.com.mx/revista/Revista_2009_3/Bioelectricidad.pdf

Flores, C. (Abril de 2014). Azotobacter: una bacteria con potencial como biofertilizante eco-amigable. Obtenido de https://www.researchgate.net/publication/274638111_Azotobacter_una_bacteria_con_potencial_como_biofertilizante_eco-amigable

Fuentes, L. (2009). Bacterias acéticas: diversidad e interacción con las plantas. Obtenido de http://www.elementos.buap.mx/num49/pdf/47.pdf

HIMEDIA. (2015). Ashbys Mannitol Agar. Obtenido de http://himedialabs.com/TD/M706.pdf

Lawlor, S. (2016). Aislamiento de bacterias electrogénicas a partir de suelos y sedimentos de Uruguay. Montevideo: UdelaR. Obtenido de http://www.bib.fcien.edu.uy/files/etd/pasan/uy24-18328.pdf

Mejía, A. (2015). Práctica 5.1 Aislamiento de microorganismos. Obtenido de http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/PracticaAislamientoDeMicroorganismos_21549.pdf

Romero, A., Vásquez, j., & Gonzalez, A. (2012). Bacterias, fuente de energía para el futuro. Tecnura. Obtenido de http://www.scielo.org.co/pdf/tecn/v16n32/v16n32a11.pdf

Serment, J. (2017). DETECCIÓN Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS EXOELECTRÓGENOS A PARTIR DE LODOS DEL RÍO LERMA, ESTADO DE MÉXICO, MÉXICO. México: Revista de Contaminación Ambiental.

UNAM. (2014). Cepario. Obtenido de Facultad de Química- UNAM: https://quimica.unam.mx/investigacion/servicios-para-la-investigacion/cepario/

UNC. (2016). FUNDAMENTOS Y TECNICAS PARA LA PRESERVACION. Bogotá: UNC.


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